描述:钙黄绿素-AM (Calcein-AM) 和碘化丙啶 (PI) 可分别对活细胞和死细胞染色,用于同时对活细胞和死细胞进行荧光染色分析。Calcein-AM是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂,发绿色荧光(Ex=490nm, Em=515nm),在传统的Calcein(钙黄绿素)基础上引入乙酰甲氧基甲酯(AM)基团,增加了疏水性,使其能够轻易穿透活细胞膜。进入细胞后,Calcein-AM(本身不发荧光)被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein,从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。与其它同类试剂如BCECF-AM和CFDA相比,Calcein, AM细胞毒性极低,是最适合用于活细胞染色的荧光探针,而且不会抑制任何的细胞功能,如增殖和淋巴球的趋化性。碘化丙啶(Propidium iodide,PI)不能穿过活细胞的细胞膜,仅能穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核,并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光(Ex=535 nm, Em=617 nm),因此PI仅对死细胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激发,因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。而用545 nm激发,仅可观察到死细胞。 试剂盒经过优化,单次可进行200μl细胞悬液染色。
规格:500次
组成及保存:
Calcein-AM Solution(2mM) 50μL -20°C 避光干燥保存
PI Solution(2 mM) 150μL -20°C 避光干燥保存
一年有效
操作步骤:
1. 工作液的配制
1)先将低温保存的 Calcein-AM 溶液 (2 mM)和 PI 溶液(2 mM)平衡至室温。
注意:第一次使用可对母液进行分装,以减少反复冻融次数。
2)取5μl Calcein-AM 溶液 (2 mM)和 12.5μl PI 溶液(2 mM)至 5ml 1xPBS缓冲液(pH 7.4),充分混匀。 得到 Calcein-AM 的工作液浓度2μM,PI 的工作液浓度5μM。
由于不同细胞系的最佳染色条件不同,初次实验建议做梯度实验,以确定 Calcein-AM 和 PI 的最适浓度。
梯度筛选的原则为 使用最低的探针浓度得到最好的荧光结果。
注意:由于 Calcein-AM 的稳定性比较差,此染色工作液必须现配现用,且在当天用完。
2. 染色步骤
2.1 贴壁细胞,先用细胞刮刀或者胰酶-EDTA消化细胞,离心收集细胞(1000 rpm,3min)。
悬浮细胞,直接离心(1000 rpm,3min)收集细胞。
2.2 去上清,用 1xPBS缓冲液(pH7.4)洗涤细胞2~3次,去除残留的酯酶活性。
注意:由于培养基中的血清等含有酯酶,Calcein-AM遇水会分解,导致空白上升,所以需要数次离心,用PBS洗涤数次直到完全洗净。
2.3 制备细胞悬液,使其密度为 1×10 5~1×10 6细胞/ml。
2.4 取100μl染色工作液加入200μl细胞悬液内,混匀,37℃孵育15min。
注意:如果需要,可延长孵育时间至 30min。
2.5 荧光显微镜下使用 490±10 nm 激发滤片同时检测活细胞(黄绿色荧光)以及死细胞(红色荧光)。另外,使用545nm的发射滤片仅能观察到死细胞。也可以直接在荧光酶标仪下使用合适的滤片进行检测。
注意:可以使用以下方法优化两种荧光染料的最佳工作浓度。
a) 在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黄皂苷中孵育10分钟或在70%乙醇中孵育30分钟制备死细胞;
b) 用0.1-10μM的PI溶液进行死细胞染色,以得到仅对细胞核染色,而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。
c) 用0.1-10μM的Calcein-AM进行死细胞染色,以得到不会对细胞质染色的最佳工作浓度。然后用此浓度进行活细胞染色。
注意事项:
1)由于 Calcein-AM 对湿度非常敏感,若是 Calcein-AM 溶液每次取完需要量后,必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量,分装密封保存。Calcein-AM 工作液必须现配现用。
2)碘化丙啶(PI)操作时一定要注意防护。若接触到皮肤,需要立即用自来水清 洗。
3)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。