Caspase-3酶活性测定试剂盒 C1113
描述：
Caspase-3是凋亡过程中最主要的终末蛋白酶，也是研究最多的caspase；它激活pro-caspase-2,6,7,9，特异水解多种关键凋亡蛋白如PARP，介导染色质固缩、凋亡小体生成、核DNA断裂。测定原理基于Caspase-3特异水解多肽底物DEVD-pNA (Asp-Glu-Val-Asp-p-nitroanilide)，释放的游离硝基苯胺pNA在405nm有最大吸光度。采用可见光光度比色法测定pNA而得到Caspase活性。适用于检测哺乳动物组织、细胞Caspase-3活性。
组成 所示为100次检测, 50次检测试剂量减半
1. 裂解缓冲液20ml, 4 oC
2. 反应缓冲液10ml, 4 oC
3. 底物 0.5ml, -20 oC避光
4. 10mM pNA标准品0.2ml, -20 oC避光
试剂常温运输，到达后按要求储存，1年内稳定。
所需仪器：
可见光分光光度计配100μl比色杯，或酶标仪。最佳波长405nm，也可测OD400~450nm但灵敏度略降。
组织细胞准备：
Caspase活性测定值低，最常见原因是未发生凋亡或细胞量太少，其次是观测时间点不恰当。诱导凋亡时，并非剂量越大时间越长Caspase活性就越高。可设置不同剂量和时间点如0、2、4、8、16、24小时，以检测最佳的观察点。通常2×107细胞或2mg组织裂解于1ml可产生1~3mg/ml蛋白。初次测定时，单个测定反应可加~200μg蛋白物对应于2×106细胞或2个孔的6孔板细胞。最少，单个测定反应需加20μg蛋白对应于2×105个细胞或2个孔的12孔板细胞。勿用丝氨酸蛋白酶抑制剂如E-64和leupeptin以免抑制Caspase活性。
1. (1)细胞裂解：1000g 5分钟收集细胞，吸尽上清。每2~10×106细胞加50~100μl裂解液震荡裂解，冰浴10分钟，再次震荡。(2)组织裂解：3~10mg组织加100 μl裂解液放入小型玻璃匀浆器，上下匀浆30次。转移匀浆液于离心管。
2. 4 oC 12,000g 10分钟，取上清测定，或-70 oC保存。
3. 蛋白定量：用Bradford法测定蛋白浓度。裂解液含还原剂不宜采用BCA法。应使蛋白浓度达到1-3 mg/ml，相当于每10 μl待测样品含10-30μg蛋白，否则应增加细胞用量。
测定pNA标准曲线：
1. 用反应缓冲液稀释10mM pNA标准品为200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125μM。设置不加pNA的零管。
2. 每一浓度取100 μl加入96孔板或100μl比色杯，测定405nm吸光度OD值。
3. 每一浓度标准管OD405值为x轴，对应的pNA浓度为y轴，用Excel制作pNA浓度对OD405值的标准曲线。
样品测定操作：
1. 按下表设置96孔板反应体系。底物最后加入以使各管反应起始时间相同。设置不加样品的空白对照管。酶活力不足或过高，可增加或减少样品。
2. 盖紧96孔板盖子并用封口膜密封。37 oC反应2小时，肉眼可见颜色变黄时的OD405值约为0.2，此时即可测定。颜色变化不明显可延长反应或过夜，但酶活性较强时，孵育时间过长将导致反应失去线性关系。
3. 样品管OD405减去空白对照OD405，为样品Caspase水解底物产生的pNA吸光度。根据标准曲线计算其含量，并以蛋白浓度校正之。
4. 测得的Caspase酶活性表示方法有两种。(1) Caspase活性增加的百分比：100% × 实验处理组OD / 实验对照组OD，简单而可靠。(2)样品Caspase酶活力单位/mg protein，精确但计算较复杂，参见说明。
反应体系参考表 (允许适当调整样品加样量)
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无样品
空白对照
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高酶活性
样品
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低酶活性
样品
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反应缓冲液μl
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95
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85
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60
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待测样品μl
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－
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10
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35
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底物 μl
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5
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5
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5
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总体积μl
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100
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100
|
100
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说明：
1. Caspase酶活力单位定义：参考Chemicon公司One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37 oC under saturated substrate concentrations。即当底物饱和时,一个Caspase酶活力单位定义为37 oC 1小时水解pNA底物，产生1nmol游离pNA。根据pNA标准曲线和样品OD值，可计算出Caspase酶活力单位。
2. 除了处理组外，可设置阳性凋亡诱导剂组，阴性实验对照可包括不具有凋亡诱导作用的试剂(如果能得到)处理组、溶剂对照组、或凋亡诱导零时间点。
参考文献：
1. Cohen GM. Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem J. 326, 1-16 (1997).
2. Porter AG and Janicke RU. Emerging role of caspase-3 in apoptosis. Cell Death Differ. 6, 99-104 (1999).