常温运输,4oC 1年稳定,-20oC长期保存。
描述:CHO细胞(Chinese hamster ovary cell),为上皮样细胞,通常贴壁生长、也可悬浮生长,广泛应用于基因表达、抗体研究、药物开发等生物科研领域。本转染试剂适用于多种CHO细胞的亚型。
自备试剂:无菌150mM NaCl即0.9%生理盐水或无菌蒸馏水或PBS缓冲液,用于离体细胞转染制备转染混合物。5%无菌葡萄糖,用于离体或在体转染转染混合物制备。与复合物颗粒形成有关,勿用其它缓冲液替代。
DNA、siRNA和寡聚核苷酸:建议溶于灭菌蒸馏水。质粒DNA高纯度OD260/280 ~1.8,无内毒素。可用内毒素清除剂(#D1501)清除内毒素。寡聚核苷酸和用于RNA干扰(siRNA)的核苷酸,可单独或与质粒DNA共转染,但必须使用经HPLC或凝胶洗脱纯化去除杂链的高纯度片段。siRNA和寡聚核苷酸与DNA转染及优化操作相似,但对其用量进行细致的优化很重要。
细胞准备(重要!)
接种细胞数:参见附表细胞计数接种。培养时间:转染前应培养~24h,使之处于分裂和旺盛生长期。细胞密度与转染时机:培养~24h后,细胞覆盖培养皿表面积的70~90%时为转染最佳时机。低密度细胞的转染率并不低,但总细胞数少因而蛋白表达总量也不会很高。在较高细胞密度时转染较好,但100%长满的细胞转染效率很低,因此接种细胞要均匀,以减少因局部紧密接触而致生长抑制的难转染细胞,否则最好重头接种细胞。CHO细胞转染试剂允许在细胞铺板时或铺板后立即转染,效果与贴壁后转染相似,但大大节省时间和劳动,适合高通量筛选。甚至一些难转染细胞也可尝试此即时转染方法。血清和培养基:血清和抗生素不影响转染,在10~30%血清培养基转染表达效率更高。转染混合物体积为培养基的1/10,参见表第5栏。如果培养基未明显变黄,转染前可不更换。如转染结果满意,转染后无需更换培养基。但转染混合物稀释了培养基,转染4~8小时后换培养基会可进一步增加转染效率。
CHO细胞转染试剂和DNA用量及优化
任何转染和优化方案需考虑转染试剂量、DNA量、但关键是二者所带的电荷比charge ratio简称R,即转染试剂所带正电荷基团相对于核酸负电荷磷酸基团的当量比率。通常R>3时DNA复合物带正电荷可被转染。在操作上,R值规定了二者的用量比例,适宜的R值因细胞类型和细胞密度而异。对于离体细胞转染,转染试剂用量和R值的计算公式如下:
CHO细胞转染试剂体积μl=0.4×R×DNAμg数
R=2.5×CHO细胞转染试剂体积μl¸DNAμg数
初次转染推荐设定R=6或8(附表灰色栏)在24孔板进行转染优化,确定最佳转染方案。在DNA量固定时,对R值的优化相当于优化试剂用量,建议设定R=5、7、9或者6、8、10三档。确定转染效率最高的R值后,再优化DNA用量。附表建议的DNA量已接近所列细胞数的中上限,但仍可~50%增减;也可根据实际情况在较大范围增减DNA用量(0.5~5μg DNA/1×105细胞),再按公式计算转染试剂用量。CHO细胞转染试剂在R<15时几乎没有细胞毒性,因而无需为降低毒性而优化。
贴壁细胞转染 (以24孔板为例,参见表一)
1. 参见表一第4、5栏。将1μg DNA稀释于100μl无菌生理盐水或无菌蒸馏水或PBS缓冲液(自备,勿用其它缓冲液但可用5%葡萄糖代替),可振荡混匀。
2. 取2.4μl CHO细胞转染试剂加至DNA溶液,勿用相反的加样顺序。立即振荡混匀,低速瞬时离心将液体甩至管底。
3. 室温放置15分钟。
4. 将100μl转染混合物直接加至1ml含血清培养基中(参见表一最右栏),倾斜转动培养板混匀。转染前可不更换培养基。
5. 培养24~48小时检测基因表达,或1:10传代后加抗生素筛选。转染后无需更换培养基。但转染混合物稀释了培养基,转染4~8小时后换培养基可进一步增加转染效率。
表一 CHO转染试剂与贴壁细胞加样和优化表
细胞
|
DNA与稀释
|
CHO转染试剂体积μl
|
培养基体积ml
|
培养皿
|
面积 cm2
|
接种细胞
|
DNA
μg
|
生理盐水或无菌蒸馏水或PBS缓冲液μl
|
R=5
|
R=6
|
R=7
|
R=8
|
R=9
|
R=10
|
96-well
|
0.3
|
1.5 × 104
|
0.25
|
20
|
0.5
|
0.6
|
0.7
|
0.8
|
0.9
|
1
|
0.2
|
48-well
|
1
|
5 × 104
|
0.5
|
50
|
1
|
1.2
|
1.4
|
1.6
|
1.8
|
2
|
0.5
|
24-well
|
2
|
1 × 105
|
1
|
100
|
2
|
2.4
|
2.8
|
3.2
|
3.6
|
4
|
1
|
12-well
|
4
|
2 × 105
|
2
|
100
|
4
|
4.8
|
5.6
|
6.4
|
7.2
|
8
|
1-2
|
6-well
35-mm
|
10
|
4 × 105
|
3
|
200
|
6
|
7.2
|
8.4
|
9.6
|
10.8
|
12
|
2-4
|
60-mm
25-cm2
|
28
|
8 × 105
|
5
|
500
|
10
|
12
|
14
|
16
|
18
|
20
|
5-10
|
100-mm
75-cm2
|
75
|
2 × 106
|
10-15
|
1000
|
20-30
|
24-36
|
28-42
|
32-48
|
36-54
|
40-60
|
15
|
注计算公式:CHO转染试剂体积μl = 0.4 × R × DNA μg数
贴壁细胞在铺板时转染、或铺板后立即转染
1. 细胞准备:用含血清培养基洗涤消化的细胞,去除消化酶。用含血清培养基制备细胞悬液,细胞量稍大些,以转染后24h细胞生长密度达90%,或转染48h内完全长满为宜。
2. 制备转染混合物,参照表一和上述贴壁细胞转染步骤。
3. 铺板后立即转染:将细胞悬液加到培养皿中,然后立即加入CHO转染试剂-DNA转染混合物,混匀。
4. 铺板的同时转染:将CHO转染试剂-DNA转染混合物预先加到培养皿中,然后立即加入细胞悬液。
5. 培养24~48小时检测基因表达。
悬浮细胞转染
以24孔板为例。
1. 按照表二准备细胞和DNA。使用含血清培养基。通常悬浮细胞转染CHO转染试剂和DNA用量比贴壁细胞要大。初始转染推荐R=6,随后可根据转染效率设R=6、7、8、9、10优化。注意转染DNA量参见表二适当再增加约30%并设R=8按公式计算试剂量。
2. 悬浮细胞转染:参见贴壁细胞转染方法制备转染试剂和DNA混合物,室温放置20分钟后直接加至1ml含血清培养基的细胞悬液中。培养24~48小时进行后续实验。
表二 CHO转染试剂转染悬浮细胞加样和优化表
细胞
|
DNA与稀释
|
CHO转染试剂体积μl
|
培养基体积
|
培养皿
|
面积 cm2
|
接种细胞
|
DNA
μg
|
生理盐水或无菌蒸馏水或PBS缓冲液μl
|
R=6
|
R=8
|