描述：RNA Trip LS (液体样品总RNA提取试剂)特别加强了对液体标本如全血、悬浮细胞、病毒样品等RNA的提取能力。用RNAtrip LS试剂提取液体标本RNA时，无需事先分离其中的细胞、细菌、病毒等病原微生物，直接将液体标本与RNAtrip LS试剂混合即可，极大简化了样品的提取前处理过程。并且其提取能力强大，甚至可以从已经凝固的血液块中提取出高纯度的RNA。使用方法与RNAtrip 和TRIzol相似，可在30－60分钟内完成。获得的高纯度总RNA可用于RT-PCR、Northern Blot、RNA酶保护、Poly(A) mRNA纯化、体外翻译等实验。
血液RNA提取试剂(#R1040)具有与RNAtrip LS相似的特征，可以使用同一说明书。
储存：4 oC密封避光保存一年以上有效。
适用：
(1) 液体标本(200μl/ml): 全血、体液、尿液，悬浮细胞、病毒微生物样品等。
(2) 培养细胞 (5-10x106细胞/ml): 真核细胞，细菌，酵母。
(3) 固体组织 (50-100mg/ml ): 人、动物、植物的各种新鲜或冻存组织。
操作准备：
极微量的RNA酶都会导致RNA降解。RNA酶污染主要来自以下五个方面：(1) 来自实验人员的双手。(2) 来自器皿、吸头离心管、自备液体。(3) 组织细胞破碎不可避免地释放内源RNA酶。(4) RNA未能完全与蛋白质分离。(5) RNA沉淀和溶解时来自吸头离心管和溶液。我们的Step by Step质量监测表明，RNAtrip LS试剂可100％抑制内源性和实验用品引入的外源RNA酶污染，并在随后的分离步骤极为有效地清除蛋白包括RNA酶。因此在有RNAtrip LS存在的情况下高压消毒30分钟的吸头离心管和溶液，可以胜任RNA提取操作。然而，一旦离开RNAtrip LS试剂的保护，如在沉淀和溶解步骤，来自吸头离心管和液体的RNA酶污染可能导致RNA降解。因此在这些步骤应严格使用高压消毒用品。戴手套无疑是有益的，但戴口罩和帽子则无必要。只要严格按照本指南进行准备和操作，使用RNAtrip LS试剂总是能获得完整的高纯度总RNA。这里描述的仅是针对RNAtrip LS试剂的实验准备方案，对其它来源RNA提取试剂未做全面检查。
1. 固体组织破碎设备。准备下列装置之一，1)玻璃匀浆器。必要时泡酸清洁，用高压灭菌蒸馏水洗涤数次。2)研钵。适用于液氮冻存组织的研磨，清洗方法同玻璃匀浆器。3)组织细胞超声破碎仪器。探头插入装满蒸馏水的试管或烧杯中，开启超声清洗探头30秒至1分钟。4)高速机械匀浆器(Polytron，Tekmar或类似产品)。打开开关，在蒸馏水中清洗分散器头数次。对这些装置的部分部件高压消毒30分钟是保险的措施，但使用RNAtrip LS这种处理并不必要。
2. 高压蒸汽30分钟消毒一次性吸头离心管。RNA沉淀和溶解之后，应严格使用高压消毒的一次性用品。然而RNAtrip LS能在RNA酶污染环境下工作，在裂解步骤可使用未高压但洁净的一次性吸头和离心管，但仅推荐在紧急情况下这样做。由于不可预测的原因，如动物已经处死，组织已取出，细胞已收取，而吸头和离心管尚未高压处理。这仅适用于RNAtrip LS试剂，对其它来源RNA提取试剂无效。此时保险做法是使用普利莱公司的组织RNA保护液(Cat# R1030)，把来不及处理的标本保存在RNA保护液中，25 oC保存2周，4 oC保存4周，－20 oC保存数月，标本中RNA不会降解。
3. DEPC处理的双蒸水。加DEPC到水中至终浓度为0.01% v/v，室温过夜，高压消毒30分钟。用于溶解RNA，配制TE缓冲液和75％乙醇。
4. 普通双蒸水。高压消毒30分钟，用于冲洗器皿，配制琼脂糖凝胶和电泳用缓冲液。注意溶液配制后高压灭菌，但琼脂糖不能高压处理。
5. 冰盒和湿冰。在冰上进行操作有助于减少RNA降解。
6. 异丙醇，氯仿，纯乙醇，分析纯。75％乙醇用高压消毒的蒸馏水配制。
7. 其它用品：电泳槽，双蒸水冲洗。离心机和加样器，无需处理。
8. 戴手套。注意某些实验如提取质粒DNA使用大量RNA酶，为防污染须特别清洗实验器具和实验区域。
RNA提取程序
1. 组织细胞破碎与裂解
冰上操作。立即并快速破碎组织至关重要。组织细胞过量不仅使RNA得率下降，还将导致DNA和蛋白质污染。在紧急情况下，如动物已处死，组织已取出，细胞已收取，异地取送标本，用户尚未做好实验准备时，推荐用户把组织细胞储存在RNA保护液(Cat# R1020)中，保证标本中的RNA不会降解。
(1) 液体标本：全血、体液、尿液，悬浮细胞、病毒微生物样品等。每200ml液体样品加1 ml RNAtrip LS，置冰上。未抗凝的凝固血液按固体组织处理。
(2) 培养细胞。贴壁细胞：弃培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞一次。每5-10′106个细胞加1 ml RNAtrip LS试剂，但加入量必须有效地覆盖瓶皿的细胞表面。一个75 cm2瓶皿的细胞通常需要 2 ml提取液，一个35 cm2瓶皿的细胞需要 1 ml提取液，更小的培养瓶皿可使用更少的提取液，但后续操作会因体积过小而极为不便。晃动瓶皿或用吸头吹打使提取液流过并裂解所有细胞。置冰上1－5分钟，倾斜瓶皿使粘稠的裂解物聚于一处以便取出。悬浮细胞：低速离心收集细胞，将细胞快速重悬于50-100ml的PBS或去离子水中，每5-10′106细胞加1 ml RNAtrip LS裂解。注意直接裂解未重悬的细胞沉淀，裂解物将十分粘稠而难以分散。细菌酵母：离心收集沉淀，加入50-100ml去离子水重悬细胞。每107细胞加入1-2 ml RNAtrip LS直接裂解。某些细菌和酵母细胞可能需要匀浆破碎。
(3) 动物组织。按比例每50-100 mg组织加1 ml RNAtrip LS试剂。用研钵研磨：仅适用于液氮冻存组织。组织放在研钵中研成粉末，加1 ml RNAtrip LS试剂，继续研磨至组织完全裂解。用玻璃匀浆器匀浆：加入RNAtrip LS上下手动匀浆组织10-15次。用高速机械匀浆器：将组织放入塑料试管内，试管置冰浴烧杯中，加入RNAtrip LS试剂，将分散器头垂直插入管内与组织块接触，转速12,000-20,000 rpm，上下移动试管10-20次，直到组织完全打散，无肉眼可见大块。有些结缔组织难以完全打碎，可以继续下一步操作。用超声仪：需根据机器型号进行预试验，选取能有效破碎组织的功率和时间。
2. 将组织细胞裂解物转移到1.5 ml离心管，置冰上10分钟。如需暂停操作，裂解物可冻存于－70 oC至少一个月。
3. 加入0.2体积的氯仿(0.2ml)，充分颠倒混匀，冰上孵育1－5 分钟，溶液开始分相。有时分相不明显，不影响提取。
离心12,000g 4 oC 10 分钟，溶液分为两相。RNA保留于上层无色透明水相约0.6ml，下层为有机相，两相界面是一层薄膜其厚度与组织细胞类型和多少有关。小心吸出上层水相转移到新离心管，但应留0.5－1 mm厚水相，以免扰动和吸入下面的碎片和无机相。如吸入无机相和碎片，应将所取水相放回管中并重新离心10分钟，再吸取水相。这一点至关重要，违背此原则容易导致RNA降解和DNA污染。
4. 加入等体积异丙醇(0.5ml)于含有上清的新离心管中，充分混匀。冰上孵育10 分钟绰绰有余。但－20 oC 放置一至数小时，可回收几乎所有的RNA。如需尽可能多的RNA，或起始组织细胞的量很少，或用户需要暂停操作时，可以这样做。用更低的温度和更长的时间进行沉淀并不必要。
5. 离心, 12,000g，4 oC，10分钟。小心弃上清，管底可见少许黄白色RNA沉淀。如初始组织细胞量少，RNA沉淀用肉眼几乎难辨，但不影响实验。
6. 洗涤沉淀。立即加入1 ml 75%乙醇，颠倒混匀数次，12,000g 5分钟。弃上清，尽量吸去管壁上的液体。乙醇洗涤后RNA沉淀容易漂浮，勿倒掉RNA沉淀。此时可将RNA沉淀保存在75%乙醇中，4 oC一周或－20 oC一年。
7. 敞开管口空气干燥5-10分钟，RNA沉淀干燥至胶冻状即可。过分干燥将使RNA难以溶解。用50-100 ml DEPC处理的高压消毒纯水或TE溶解沉淀。如RNA难溶，可55 oC加热10分钟，或反复冻融数次助溶。RNA溶液可保存于－70 oC或液氮中；或加3倍体积乙醇－20 oC冻存，用时离心沉淀。
8. 测定OD值。计算RNA浓度和OD260/280比值。RNAtrip LS提取的RNA绝少蛋白污染，比值通常在1.6－2.0之间均属正常。OD260/280比值受很多因素影响。起始组织量过大或RNAtrip LS试剂过少，或吸取了有机相或碎片，将使OD260/280比值降低，应预以避免；RNA用水溶解或pH偏酸OD260/280偏低，而用TE或离子强度较高的溶液溶解时该比值较高，但均不影响RNA使用。用户应该知道，即便是已降解的RNA，该比值也能达到看似完美的2.0左右，因此该比值并非判断RNA降解与否的指标。可进行RNA琼脂糖电泳检查RNA完整性(见说明2)。
说明：
1. 每100mg组织RNA预期得率为：肝脾60－100mg, 肾50mg, 脑组织10-15mg, 胎盘20－40mg, 脂肪50mg。1 x 107个细胞通常得50－100mg。
2. 测定OD值，根据OD260计算RNA浓度。OD260/280比值可初步判断RNA质量，比值在1.6-2.0之间均属正常。起始组织量过大，或吸取了有机相或碎片，将使RNA样品中蛋白和杂质含量高，RNA沉淀乙醇洗涤不充分(步骤8)，均可导致OD260/280比值降低。例如，RNA用水溶解或pH偏酸OD260/280偏低，用TE或离子强度较高的溶液溶解时较高，但均不影响RNA后续使用。切记即便是已降解的RNA，OD260/280比值也能达到看似完美的2.0左右，因此该比值并非判断RNA降解与否最佳的指标。判断RNA质量的最佳途径是进行普通RNA琼脂糖电泳检查RNA完整性。
3. 检查RNA完整性。取1 mg RNA样品进行1－1.5%普通琼脂糖凝胶电泳。溴化乙锭染色，紫外灯观察。28S RNA~5 kb亮度应该约为18S RNA~2 kb的两倍，有时可见0.1－0.3 kb 的5S RNA。
4. 调整RNA溶液的体积或重沉淀RNA。(1) 加入适量DEPC处理过的高压消毒纯水或TE缓冲液，于RNA溶液中，使溶液体积补齐到约400 ml；(2) 加入 0.1 体积的3M 醋酸钠 pH 5.2，混匀；(3) 加入2.5体积的纯乙醇，混匀；(4) 冰上孵育10 分钟；(5) 12,000g 4 oC 离心10 分钟，弃上清；(6) 执行上述RNA提取程序的步骤6－8。
5. RNAtrip LS勿直接接触皮肤和吸入。如接触皮肤，立即用大量水清洗。
6. 可连续提取蛋白质和基因组DNA，可向普利莱基因公司索要说明书。