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TRIzol(总RNA提取试剂)
货号:R1030  |  规格:100ml  |  品牌:Applygen
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描述:TRIzol是一种快速从组织细胞中提取总RNA的单相试剂。在样品裂解过程中TRIzol能够抑制RNA酶活性保持RNA完整性;加入氯仿后离心,RNA相将与DNA和蛋白质分离,随后用异丙醇沉淀RNA。如果需要还可以继续提取DNA和蛋白质。纯化的总RNA可用于RTPCRNorthern BlotRNA酶保护、Poly(A) mRNA纯化、体外翻译等实验。

储存4oC密封避光保存两年有效。

适用:

(1) 固体组织 (100 mg /ml ): 人、动物、植物的各种新鲜或冻存组织。

(2) 培养细胞 (5~10 x 106细胞/ml): 真核细胞,细菌,酵母。

(3) 液体标本(100 μl/ml): 全血、体液、尿液,病毒样品等。

操作准备

极微量的RNA酶都会导致RNA降解。分离RNARNA酶污染主要来自以下五个方面:(1) 实验人员的双手。(2) 器皿、吸头离心管、自备液体。(3) 组织细胞破碎不可避免地释放内源RNA酶。(4) RNA未能完全与蛋白质分离。(5) RNA沉淀和溶解时来自吸头离心管和溶液。Trizol可抑制RNA酶活性因此在有Trizol存在的步骤中,使用高压消毒20分钟的吸头离心管和溶液即可胜任RNA提取操作。然而在RNA溶解之后,来自实验材料的RNA酶污染将会导致RNA降解,应严格使用高压灭活RNA酶的用品。戴手套无疑是有益的,但戴口罩和帽子则无必要。

1. 固体组织破碎设备。准备下列装置之一,1)玻璃匀浆器。必要时泡酸清洁,用高压灭菌蒸馏水洗涤数次。2)研钵。适用于液氮冻存组织的研磨,清洗方法同玻璃匀浆器。3)组织细胞超声破碎仪器。探头插入装满蒸馏水的试管或烧杯中,开启超声清洗探头30秒至1分钟。4)高速机械匀浆器(PolytronTekmar或类似产品)。打开开关,在蒸馏水中清洗分散器头数次。

2. 高压蒸汽30分钟消毒一次性吸头离心管。RNA沉淀和溶解之后,应严格使用高压消毒的一次性用品。由于不可预测的原因,如:动物已经处死,组织已取出,细胞已收取,而吸头和离心管尚未高压处理。此时保险做法是使用普利莱基因技术公司的另种产品――组织RNA保护液(Cat# R1030),用户可把来不及处理的标本保存在RNA保护液中,37 oC保存3天,25 oC保存2周,oC保存4周,-20 oC保存数月,固体或液体标本中RNA不会降解。

3. DEPC处理的双蒸水。加DEPC到水中至终浓度为0.01% v/v,室温过夜,高压消毒30分钟。用于溶解RNA,配制TE缓冲液和75%乙醇。

4. 普通双蒸水。高压消毒30分钟,用于冲洗器皿,配制琼脂糖凝胶和电泳用缓冲液。注意溶液配制后高压灭菌,但琼脂糖不能高压处理。

5. 冰盒和湿冰。在冰上进行操作有助于减少RNA降解。

6. 异丙醇,氯仿,纯乙醇,分析纯。75%乙醇用高压消毒的蒸馏水配制。

7. 其它用品。电泳槽,双蒸水冲洗。离心机和加样器,无需处理。

8. 戴手套。注意某些实验如提取质粒DNA使用大量RNA酶,为防污染须特别清洗实验器具和实验区域。

RNA提取程序

1. 组织细胞破碎与裂解

冰上操作快速破碎组织至关重要。组织细胞过量不仅使RNA得率下降,还将导致DNA和蛋白质污染。

(1) 固体组织。按比例每50-100 mg组织加1 ml Trizol试剂。用研钵研磨:仅适用于液氮冻存组织。组织放在研钵中研成粉末,加1 ml Trizol试剂,继续研磨至组织完全裂解。用玻璃匀浆器匀浆:加入Trizol上下手动匀浆组织10-15次。用高速机械匀浆器:将组织放入塑料试管内,试管置冰浴烧杯中,加入Trizol试剂,将分散器头垂直插入管内与组织块接触,转速12,000-20,000 rpm,上下移动试管10-20次,直到组织完全打散,无肉眼可见大块。用超声仪:根据机器型号进行预试验,选取能有效破碎组织的功率和时间。

注意:(1)由于Trizol卓越的性能,通常用50-100 mg组织可获得足量的RNA,对绝大多数实验目的绰绰有余。加入过量组织或过少Trizol容易导致提取失败。(2)少量难以打碎的组织碎片不影响后续RNA提取。(3)用研钵和玻璃匀浆器匀浆破碎组织时,应略微多加一些裂解液,以补充裂解产物粘在容器壁上造成的体积丢失。

(2) 培养细胞。贴壁细胞:弃培养基,用PBS缓冲液冲洗细胞一次。每5-10′106个细胞加1 ml Trizol试剂,但Trizol加入量必须有效地覆盖瓶皿的细胞表面。一个75 cm2瓶皿的细胞通常需要2 ml提取液,一个35 cm2瓶皿的细胞需要 1 ml提取液,更小的培养瓶皿可使用更少的提取液,但后续操作会因体积过小而极为不便。晃动或用吸头吹打使提取液流过并裂解所有细胞。置冰上5分钟,倾斜瓶皿使粘稠的裂解物聚于一处以便取出。悬浮细胞:低速离心收集细胞,将细胞快速重悬于50-100mlPBS或去离子水中,每5-10′106细胞加1 ml Trizol裂解。注意直接裂解未重悬的细胞沉淀,裂解物将十分粘稠而难以分散。细菌酵母:离心收集沉淀,加入50-100ml去离子水重悬细胞。每107细胞加入1-2 ml Trizol直接裂解。某些细菌和酵母细胞可能需要匀浆破碎。

(3) 液体标本:如体液、尿液、全血。每100ml液体样品加1 ml Trizol,置冰上1-3分钟。未抗凝的凝固血液按固体组织处理。Trizol Liq (Cat# R1020)产品专门用于液体标本RNA提取。

2. 将组织细胞裂解物转移到1.5 ml离心管,置冰上10分钟。

优化步骤:如果组织裂解物含较多的碎片,或提取植物组织,12,000g 4 o离心10 分钟,取上层裂解液,弃管底碎片和粘稠DNA。如果提取脂肪组织,12,000g 4 o离心10 分钟,小心吸掉最上面的油层,弃去。再取裂解液,弃管底碎片和粘稠DNA。取出的裂解液如带少量油滴不影响提取。

3. 加入0.2体积的氯仿(0.2ml),充分颠倒混匀,冰上孵育1-5 分钟,溶液开始分相。有时分相不明显,不影响提取。

4. 离心12,000 ′ g 4 oC 10分钟,溶液分为两相。RNA在上层水相,下层为有机相,两相界面是一层薄膜其厚度与组织细胞类型和多少有关。小心吸出0.5ml上层水相转移到新离心管。

注意:取上清液时应保留0.5-1 mm厚的水相,以免扰动和吸入下面的碎片和有机相。如果吸入,应将所取的上清液放回管中并重新离心10分钟,再次吸取水相。这一点至关重要,违背此原则容易导致RNA降解和DNA污染。如需同时提取DNA或蛋白质,则保留中间相和下层有机相,向公司索要操作方法。

5. 加入等体积异丙醇(0.5ml)于上清充分混匀。冰上孵育10 分钟沉淀RNA。用更低的温度和更长的时间进行沉淀并不必要。如起始组织细胞的量很少20 oC放置一至数小时可沉淀几乎所有的RNA

注意:从富含多糖的植物组织或富含糖原的动物肝脏组织提取RNA时,按以下步骤进行:以每1 ml Trizol裂解组织,加氯仿后离心得到约0.5 ml上清液计算,分别加入上清液一半体积即0.25 ml 的高盐溶液(0.8 M 柠檬酸钠和1.2 M NaCl)0.25 ml异丙醇,混匀。执行下面的离心沉淀步骤6。离心后可有效沉淀RNA,但多糖或糖原存留在上清可被弃去。从富含多糖的植物和动物肝脏组织提取RNA时,推荐使用植物RNA分离试剂Plant TrizolPlant RNA Extraction Kit

6. 12,000go离心10分钟。管底可见少许RNA沉淀。

注意:如初始组织细胞量少,RNA将附着在管壁,用肉眼几乎难辨沉淀,但不影响实验。如RNA沉淀量很多并呈胶冻状,通常表明有蛋白污染。应仔细检查操作步骤。

7. 弃上清。立即加入1ml 75%乙醇,颠倒混匀数次洗涤沉淀。12,000g离心5分钟。弃上清,尽量完全吸去管壁上的液体。

注意:乙醇洗涤后RNA沉淀容易漂浮,勿倒掉或吸走RNA沉淀。RNA沉淀在75%乙醇中可在oC

保存一周或在-20 oC保存一年。

8. 敞开管口,空气干燥5-10分钟使残留液体挥发,RNA略微沉淀干燥即可。用50-100 ml自备的DEPC处理的高压消毒纯水TE溶解沉淀。RNA溶液可保存于-70 oC或液氮中。

注意:过分干燥将使RNA难以溶解。55 oC加热或反复冻融数次可以助溶。RNA溶液加3倍体积乙醇冻存于-20 oC,用时离心沉淀。

说明

1. 100mg组织RNA预期得率为:肝脾60100mg, 50mg, 脑组织10-15mg, 胎盘2040mg, 脂肪50mg1 x 107个细胞通常得50100mg

2. 测定OD,根据OD260计算RNA浓度。OD260/280比值可初步判断RNA质量,比值在1.6-2.0之间均属正常。起始组织量过大,或吸取了有机相或碎片,将使RNA样品中蛋白和杂质含量高,RNA沉淀乙醇洗涤不充分(步骤8),均可导致OD260/280比值降低。例如,RNA用水溶解或pH偏酸OD260/280偏低,用TE或离子强度较高的溶液溶解时较高,但均不影响RNA后续使用。切记即便是已降解的RNAOD260/280比值也能达到看似完美的2.0左右,因此该比值并非判断RNA降解与否最佳的指标。判断RNA质量的最佳途径是进行普通RNA琼脂糖电泳检查RNA完整性。

3. 检查RNA完整性。取mg RNA样品进行1%普通琼脂糖凝胶电泳。溴化乙锭染色,紫外灯观察。28S RNA~5 kb亮度应该约为18S RNA~2 kb的两倍,有时可见0.1-0.3 kb 5S RNA

4. 调整RNA溶液的体积或重沉淀RNA(1) 加入适量DEPC处理过的高压消毒纯水或TE缓冲液,于RNA溶液中,使溶液体积补齐到约400 ml(2) 加入 0.1 体积的3M 醋酸钠 pH 5.2,混匀;(3) 加入2.5体积的纯乙醇,混匀;(4) 冰上孵育10 分钟;(5) 12,000g 4 o离心10 分钟,弃上清;(6) 执行上述RNA提取程序的步骤68

5. Trizol勿直接接触皮肤和吸入。如接触皮肤,立即用大量水清洗。

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