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植物RNA提取试剂盒(适用含高多糖多酚植物组织)
货号:R1050-100  |  规格:100次  |  品牌:Applygen
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描述:一些植物组织富含多糖、多酚、次级代谢产物,在细胞裂解后可与RNA紧密结合形成难溶的胶冻状沉淀导致提取失败,明显抑制下游RNA反应如逆转录和PCR植物RNA提取试剂盒组提供了卓越的植物RNA分离方案。首先,Lysis Solution采用复合型强变性剂和裂解剂能够裂解坚硬的植物组织,并完全抑制RNA酶活性;同时,Lysis Solution独特的内在成分既能抑制多酚氧化,又能最大限度地结合植物多糖和多酚以及次生代谢产物。其次,强烈的有机抽提步骤可进一步灭活RNA酶,去除蛋白质和基因组DNA污染,并进一步去除植物多糖和多酚以及次生代谢产物。随后,任何残留的多糖和多酚可进一步被Plant RNA Aid结合,并通过离心去除。RNA提取60分钟内完成,所提取的RNA纯度极高,完全不含DNA和多糖污染,可用于构建cDNA文库、RT-PCRNorthern转印分析、Poly(A) mRNA纯化、体外翻译、和RNA酶保护实验。由于动物肝脏和肌肉等组织富含糖原,此植物RNA提取试剂盒也特别适用从动物肝脏或肌肉组织提取高纯度的总RNA

组成

(1) Lysis Solution: 50ml,用于植物组织裂解、分离RNA、去除植物多糖和多酚;

(2) Extraction Reagent: 50ml用于有机抽提去除蛋白质、DNA、多糖和多酚;

(3) Plant RNA Aid: 5ml用于完全去除植物多糖多酚和次生代谢产物。

适用范围:各种植物组织如叶片、根茎、种子组织。富含多糖糖原的动物肝脏肌肉组织。每0.5ml Plant RNA Reagent可裂解50~150 mg植物组织,或′ 106个植物培养细胞。

储存条件4oC密封避光保存1有效

效果展示:

图:普利莱植物RNA试剂盒(R1050)提取的不同植物组织总RNA

左图:Lane1,紫罗兰叶片;Lane2,芦荟叶片;Lane 3,苹果果肉;Lane4,水竹叶片;Lane5,水浸泡过夜的花生。

左中图:Lane6、7,小油桐叶片RNA

右中图:Lane1,用进口TRIzol提取的苹果RNALane23:普利莱的植物RNA提取试剂盒 (R1050)提取的苹果RNA

右图:Lane1~4,杨树

用户实验用品和操作准备:

极微量RNA酶都会导致RNA降解。分离RNARNA酶污染主要来自以下五个方面:(1) 实验人员的双手。(2) 器皿、吸头离心管、自备液体。(3) 组织细胞破碎不可避免地释放内源RNA酶。(4) RNA未能完全与蛋白质分离。(5) RNA沉淀和溶解后来自吸头离心管和溶液。Lysis Solution可完全抑制RNA酶活性,Extraction Reagent灭活并在离心步骤完全清除RNA酶。二者的结合使得RNA酶不再成为问题。因此使用高压消毒20分钟的吸头离心管和溶液即可胜任RNA提取操作。然而在RNA溶解之后,来自实验材料的RNA酶污染将会导致RNA降解,应严格使用高压灭活RNA酶的用品。戴手套无疑是有益的,但戴口罩和帽子则无必要。只要严格按照本指南准备和操作,使用Plant RNA Kit总是能获得高纯度RNA

1. 固体组织破碎设备。可用下列装置之一:1)玻璃匀浆器。泡酸清洁,用高压灭菌蒸馏水洗涤数次。2)研钵。适用于液氮冻存组织的研磨,清洗方法同玻璃匀浆器。3)高速机械匀浆器(PolytronTekmar或类似产品),打开开关,在蒸馏水中清洗分散器头数次。

2. 高压蒸汽30分钟消毒一次性吸头离心管。RNA沉淀溶解之后,应严格使用高压消毒的一次性用品。然而Plant RNAtrip能在RNA酶污染环境下工作,在裂解步骤可使用未高压但洁净的一次性吸头和离心管,但仅推荐在紧急情况下这样做。

3. 普通双蒸水,高压消毒20分钟。用于冲洗器皿,配制琼脂糖凝胶和电泳用缓冲液。DEPC处理的双蒸水。加DEPC到水中至终浓度为0.01% v/v,室温过夜,高压消毒30分钟。用于溶解RNA,配制TE缓冲液和75%乙醇。

4. 湿冰。在冰上进行操作有助于减少RNA降解。

5. 其它用品。电泳槽,双蒸水冲洗。离心机和加样器,无需处理。

6. 戴手套。注意某些实验如提取质粒DNA使用大量RNA酶,为防污染,须全面仔细清洗实验器具和实验区域。

RNA提取程序

1. 植物组织细胞破碎裂解

冰上操作。立即并快速破碎组织至关重要。初始组织细胞过量不仅使RNA得率下降,还将导致DNA和蛋白质污染。

11植物组织破碎与裂解

确定组织用量:推荐按比例每50~150 mg新鲜植物组织加0.5 ml Lysis Solution,但植物组织用量的上限变化甚大。(1)某些新鲜植物组织含水量甚高,而较干燥的植物组织50mg可能已经接近上限。为获足量RNA必须测试加入每种组织的量。注意使用过量的组织将导致提取失败。(2) 软组织、叶片、花、多汁组织、发芽种子等可直接加入Lysis Solution研磨破碎,而坚硬的植物组织如种子、木质茎干等最好先在液氮中研磨破碎为粉末。

按比例每50-150 mg植物组织加0.5 ml Lysis Solution,按下列方法之一裂解组织。(1) 研钵:适用于液氮冻存组织。将液氮冻存组织研成粉末,加0.5 ml Lysis Solution,继续研磨组织至完全破碎也可转移到玻璃匀浆器继续研磨。(2) 玻璃匀浆器:放入剪碎的新鲜植物组织,加入0.5 ml Lysis Solution,放置冰上,上下手动匀浆组织10-20次。(3) 内切式高速机械匀浆器:将植物组织放入塑料或玻璃试管内,试管置冰浴烧杯中,加入0.5 ml Lysis Solution,将内切式分散器头插入管内溶液中间并与组织块接触,转速12,000-20,000 rpm,缓慢上下移动试管10-20次,直到大部分组织打散。注意:少量难以打碎的组织碎片不影响后续RNA提取。用研钵和玻璃匀浆器匀浆组织时应略微多加一些裂解液,以补充裂解产物粘在器皿壁上造成的体积丢失。破碎组织用玻璃匀浆器可能比液氮研磨方便。

12植物培养细胞的破碎与裂解

弃培养基,收集细胞。每1-5 ′ 106个细胞加0.5 ml Lysis Solution,须有效地覆盖瓶皿的细胞表面。晃动或用吸头吹打使提取液流过并裂解所有细胞。置冰上10分钟,倾斜瓶皿使粘稠的裂解物聚于一处以便取出。

将裂解产物转移到1.5 ml离心管,置冰上20-30分钟。注意:富含多糖 和多酚的植物组织可延长孵育时间至30-60分钟。

3 12,000 ′ g 4 o离心10分钟。取上清液转移到新管。注意:组织纤维碎片、植物多糖和多酚等沉淀在管底。大部分基因组DNA也在管底形成疏松粘稠的团状物。取上清液时如吸入少量拉丝状DNA粘稠物,不影响后续实验。

加入0.5ml Extraction Reagent,充分颠倒混匀,冰上孵育10分钟。

离心12,000 ′ g 4 oC 10分钟,溶液分为两相。RNA在上层水相,下层为有机相,两相界面是一层薄膜,其厚度与组织细胞类型和多少有关。小心吸出水相转移到新离心管。注意:取上清液时应保留0.5-1 mm厚的水相,以免扰动和吸入下面的碎片和有机相。如果吸入,应将所取的上清液放回管中并重新离心10分钟,再次吸取水相。这一点至关重要,违背此原则容易导致RNA降解和DNA污染。

优化步骤:对多糖含量特别丰富的植物,加入上清液1/10体积(50~70ml)Plant RNA Aid (如有沉淀,用前轻摇重悬)到上清液,混匀,冰上孵育20分钟以进一步结合植物多糖和多酚,溶液将会变浑浊。离心12,000 ′ g 4 oC 10分钟。小心吸出上层水相转移到新离心管,勿扰动和吸入下面的透明胶冻状沉淀。注意:完全去除植物多糖至关重要,否则将明显降低RNA回收率,并使沉淀呈难溶解的胶冻状。

将步骤56获得的上清液约500 ml转移到新管,加入0.7~1体积的异丙醇混匀。冰育5-10分钟已足以沉淀RNA。用更低的温度和更长的时间进行沉淀仅在组织极少时有用。

8 10,000′g 4 o离心10分钟。管底可见少许RNA沉淀。注意:如初始组织细胞量少,RNA将附着在管壁,用肉眼几乎难辨沉淀,但不影响实验。如RNA 沉淀量很多并呈胶冻状,通常表明有多糖、多酚和蛋白污染。应仔细检查操作步骤。一个补救措施是用Lysis Solution溶解沉淀,从步骤1开始重新抽提沉淀。

弃上清。立即加入1ml 75%乙醇,颠倒混匀数次洗涤沉淀。12,000 ′ g离心5分钟。弃上清,尽量完全吸去管壁上的液体。注意:乙醇洗涤后RNA沉淀容易漂浮,勿倒掉或吸走RNA沉淀。RNA沉淀在75%乙醇中可在oC保存一周或在-20 oC保存一年。

10 敞开管口空气干燥5-10分钟使残留液体挥发,RNA略微沉淀干燥即可。用50-100 ml自备的DEPC处理的高压消毒纯水溶解沉淀。RNA溶液可保存于-70 oC或液氮中。注意:过分干燥将使RNA难以溶解。55 oC加热或反复冻融数次可以助溶。RNA溶液加3倍体积乙醇冻存于-20 oC,用时离心沉淀。

说明

1. 测定OD,根据OD260计算RNA浓度。OD260/280比值可初步判断RNA质量,比值在1.6-2.0之间均属正常。起始组织量过大,或吸取了有机相或碎片,将使RNA样品中蛋白和杂质含量高,RNA沉淀乙醇洗涤不充分(步骤8),均可导致OD260/280比值降低。但切记OD260/280比值受很多非质量因素影响。例如,RNA用水溶解或pH偏酸OD260/280偏低,用TE或离子强度较高的溶液溶解时较高,但均不影响RNA后续使用。切记即便是已降解的RNAOD260/280比值也能达到看似完美的2.0左右,因此该比值并非判断RNA降解与否最佳的指标。判断RNA质量的最佳途径是进行普通RNA琼脂糖电泳检查RNA完整性。

2. 检查RNA完整性。取mg RNA样品,加5ml 纯水加1ml上样缓冲液进行1%普通琼脂糖凝胶电泳。溴化乙锭染色,紫外灯观察。

3. 勿直接接触皮肤和吸入。如接触皮肤,立即用大量水清洗。

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