■ 制品内容 (50 次量*1)
PrimeScript II RT Enzyme Mix 50 μl
5×PrimeScript II Buffer 200 μl
dNTP Mixture (10 mM each) 100 μl
Oligo dT Primer (50 μM) 50 μl
Random 6 mers (20 μM) 50 μl
PrimeSTAR GXL for RT-PCR 100 μl
5×PrimeSTAR GXL Buffer 500 μl
Control F-1 Primer*2 (20 μM) 10 μl
Control R-1 Primer*3 (20 μM) 10 μl
Positive Control RNA (2×105 copies/μl) 20 μl
RNase Free dH2O 1ml
*1 反转录反应20 μl、PCR反应50 μl，2 Step RT-PCR时可使用50次。
*2 Positive Control RNA用上游引物。
*3 Positive Control RNA用下游引物。
■ 制品说明
PCR (Polymerase Chain Reaction；聚合酶链式反应) 是一种使用两种引物扩增目的DNA的方法。虽然原理上PCR法是扩增DNA，RNA不能直接被扩增，但是经过反转录酶的作用将RNA反转录成cDNA后扩增 (RT-PCR)，PCR法便可应用于RNA的解析了。目前，此方法已广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。
PrimeScript II High Fidelity RT-PCR Kit是一种对长链RNA及富含GC序列的RNA合成cDNA时具有高保真性的RT-PCR用试剂盒。
本试剂盒中使用的PrimeScript II反转录酶是改良型的PrimeScript RTase，可在合成长链cDNA时发挥效力，同时PCR时使用了对长链及富含GC序列的cDNA扩增时具有高保真性的DNA聚合酶PrimeSTAR GXL DNA Polymerase。因PrimeScript II RTase可很好地抑制由于引物错配引起的非特异性扩增，即使使用高浓度的Oligo dT Primer进行反转录反应也不会导致cDNA合成时的阻害作用，因此使用高浓度的RNA作为模板也可进行良好的反转录反应。
本试剂盒中使用PrimeScript II RTase与RNase Inhibitor的混合型PrimeScript II RT Enzyme Mix。另外，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase克服了以往的高保真酶由于核酸浓度过高而存在的反应阻害性，在高浓度核酸存在条件下也能发挥其效力，可以在更宽广的RNA模板范围内获得cDNA扩增产物。 本试剂盒具有以下优点:
1. 能够从长链RNA及富含GC序列的RNA中获得错配率很低的cDNA扩增产物。
2. 在42℃条件下反转录反应也可以使具有复杂结构的RNA进行良好的延伸。
3. 反应体系中Total RNA的使用范围非常宽广，便于使用。
本试剂盒含有反转录反应及PCR扩增反应所需要的全部试剂。并且，也可以进行1 Step RT-PCR反应。
■ 各种引物的序列
引物名称
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各引物序列
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Random 6 mers
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Pd (N)6
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Oligo dT Primer
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Takara独自开发的dT区域的序列
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Control F-1 Primer
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5′-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3′
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Control R-1 Primer
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5′-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3′
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■ Positive Control RNA
本试剂盒中的Control RNA是以pSPTet3质粒 (质粒中的SP6启动子下游插入长约1.4 kb的pBR322来源的DNA片段，DNA片段上含有抗四环素基因) 为模板由SP6 RNA聚合酶经体外转录而得到的。
图1. Control RNA：使用Control Primer时所能扩增的DNA片段
■ 保存
-20℃。
■ 使用注意
1. 当同时需要进行数次RT-PCR反应时，应先配制各种试剂的混合液 (Master Mix；其中包括RNase Free dH2O、Buffer、dNTP Mixture等)，然后再分装到每个反应管中。这样，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验之间产生的误差。
2. 使用PrimeScript II RT Enzyme Mix、PrimeSTAR GXL for RT-PCR等酶类产品时，应轻轻混匀，避免起泡；分取之前要小心地离心收集到反应管底部；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。
3. 酶制品应在实验前才从-20℃中取出，使用后也应立即放入-20℃保存。
4. 为了防止Positive Control RNA分解，应尽量避免反复冻融。有条件的实验室最好保存于-70℃～-80℃。
5. 分装试剂时务必使用新的枪头 (Tip)，以防止样品间污染。