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■ 制品内容 (Code No.: RR019A : 100 次量*1)
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AMV Reverse Transcriptase XL (5 U/μl) (Avian Myeloblastosis Virus来源)
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50 μl
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RNase Inhibitor (40 U/μl)
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25 μl
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Random 9 mers*2 (50 pmol/μl)
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50 μl
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Oligo dT-Adaptor Primer (2.5 pmol/μl)
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50 μl
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RNase Free dH2O
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1 ml
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TaKaRa Ex Taq HS (5 U/μl)
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25 μl
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M13 Primer M4*2 (20 pmol/μl)
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50 μl
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10 × RT Buffer [100 mM Tris-HCl (pH8.3)，500 mM KCl]
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1 ml
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5 × PCR Buffer
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1 ml
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dNTP Mixture (各10 mM)
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150 μl
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MgCl2 (25 mM)
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1 ml
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Control R-1 Primer*2 (20 pmol/μl) (Positive Control RNA下游引物)
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25 μl
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Control F-1 Primer*2 (20 pmol/μl) (Positive Control RNA上游引物)
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25 μl
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Positive Control RNA*3 (2 × 105 copies/μl)
(Transcribed poly(A)+ RNA of pSPTet3 plasmid)
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25 μl
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*1：1次反应即10 μl RT及 50 μl PCR
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*2：引物序列
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引物名称
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各引物序列
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Random 9 mers
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5′-(P)NNNNNNNNN-3′
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Oligo dT-Adaptor Primer
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包含dT区域及M13 Primer M4序列。
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Control F-1 Primer
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5′-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3′
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Control R-1 Primer
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5′-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3′
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M13 Primer M4
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5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′
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*3：Positive Control RNA
本试剂盒中的Control RNA是以pSPTet3质粒 (质粒中的SP6启动子下游插入长约1.4 kb的pBR322来源的DNA片段，其DNA片段上含有抗四环素基因) 为模板由SP6 RNA聚合酶经体外转录而得到的。Control RNA (约1.4 kb) 是带有30个A碱基的具有Poly(A)+ 尾的RNA。当把Control RNA经RT-PCR合成的双链cDNA插入质粒时，该质粒便可获得四环素抗性。Control RNA简图见图1。
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图1. Positive Control RNA：使用各种引物所能扩增的DNA片段
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■ 制品说明
PCR (Polymerase Chain Reaction；聚合酶链式反应) 是一种体外扩增DNA的简单而有效的方法。虽然原理上PCR法是扩增DNA，RNA不能直接被扩增，但是经过反转录酶的作用把RNA反转录成cDNA后，PCR法便可应用于RNA的解析了。目前，此方法已广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。
TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0是使用AMV (Avian Myeloblastosis Virus) 由来的反转录酶将RNA合成cDNA，然后在同一反应管中使用Hot Start PCR用TaKaRa Ex Taq HS DNA聚合酶扩增此cDNA的RT-PCR试剂盒。本试剂盒含有从RNA到cDNA，然后使用PCR法扩增此cDNA所需的全部试剂，可实现简单高效的RNA分析。
本试剂盒中的Oligo dT-Adaptor Primer的特殊设计，大大地提高了Poly(A)+ RNA 3′端区域的cDNA合成效率。Hot Start PCR用DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS的应用，避免扩增前由于错配或引物二聚体产生的非特异性扩增。
■ 保存
-20℃。
■ RNA LA PCR的原理
本试剂盒使用AMV由来的反转录酶由RNA合成cDNA，并可在同一反应管中使用TaKaRa Ex Taq HS扩增此cDNA。Random 9 mers、Oligo dT-Adaptor Primer或特异性下游引物等均可作为反转录引物用于cDNA合成。Oligo dT-Adaptor Primer同时适用于3′-RACE实验。
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图2. RNA PCR的原理
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■ 特点
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RNA模板
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适用于所有RNA
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扩增片段大小
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≤5 kb
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反转录酶
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AMV Reverse Transcriptase XL
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DNA Polymerase
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TaKaRa Ex Taq HS
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RNase Inhibitor
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必须使用 (Kit中含有)
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合成第一条cDNA链的引物
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Random 9 mers、Oligo dT-Adaptor Primer或 特异性下游PCR Primer 可供选择
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3′-RACE法
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RT反应时使用Oligo dT-Adaptor Primer，PCR反应时下游引物使用M13 Primer M4
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操 作
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在同一反应管中进行 (反转录酶在进行PCR反应前须进行高温失活)
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■ 反转录反应时Primer的选择
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Random 9 mers
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适用于长的或具有Hairpin构造的RNA。包括rRNA、mRNA、tRNA等在内的所有RNA的反转录反应都可使用本引物。 用Random 9 mers合成的cDNA进行PCR反应时，必须使用特异性引物。
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Oligo dT-Adaptor Primer
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适用于具有Poly(A)+ Tail的RNA。(注意：原核生物的RNA、真核生物 Primer 的rRNA及tRNA以及某些种类的真核生物的mRNA不具有Poly (A)+ Tail)。 本Primer设计巧妙，反转录效率高。反转录反应后，可用M13 Primer M4进行3′-RACE实验。
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特异性下游PCR Primer
(PCR时的下游引物)
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因其必须与模板序列互补，所以只适用于Target序列已知的情况。
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■ 注意事项
1. 当同时需要进行数次反转录反应或PCR反应时，应先配制各种试剂的混合液 (Master Mix；其中包括RNase Free dH2O、Buffer、dNTP Mixture、MgCl2等)，然后再分装到每个反应管中。这样，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验之间产生的误差。
2. 使用Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor、TaKaRa LA Taq 酶等酶类时，应轻轻混匀，避免起泡；分取之前要小心地离心收集到反应管底部；由于酶保存液粘度高，分取时应慢慢吸取。
3. 酶制品应在实验前才从-20℃中取出，使用后也应立即放回-20℃中保存。
4. 分装试剂时务必使用新的枪头 (Tip)，以防止样品间污染。
5. 最佳的PCR条件，因PCR扩增仪的不同而不同，所以在使用您的样品之前最好先试做一下Control反应，以确定最佳的PCR条件。