DNA Topoisomerase I 催化4种反应：
1. 使环状超螺旋分子的超螺旋解开。
2. 在单链环状DNA分子内形成绳结 (Knotting) 和解开绳结 (Unknotting)。
3. 催化具有互补碱基序列的环状单链DNA形成双链闭环状DNA分子。
4. 2个环状双链DNA分子之中的一个存在DNA链的切口时，发生两个分子的连结反应 (Catenation) 或者逆反应 (Decatenation)。 本酶由于来源于小牛胸腺，与来源于原核生物的酶性质不同，即使在Mg2+不存在的条件下也显示活性。而且，原核生物由来的DNA Topoisomerase I 只作用负链的超螺旋分子，而本酶则能使正负两方的超螺旋分子均形成松散型。
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■ 保存
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-20℃。
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■ 起源
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Calf thymus
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■ 活性定义
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在37℃、30分钟内把0.5 μg/50 μl的超螺旋pBR322 DNA完全转换成松散型的酶的活性定义为1 unit。
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■ 使用注意
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pBR322 DNA和φX174 DNA的RF I (超螺旋分子) 用DNA Topoisomerase I 处理后电泳，胶中含溴乙锭 (EtBr) 时，反应前后DNA条带的位置不发生变化。这是因为由DNA Topoisomerase I作用而转换为松散型的DNA受EtBr的影响，再次变为超螺旋状态。因此，使用Topoisomerase I反应后，一般使用不含EtBr的琼脂糖凝胶电泳，电泳终了后再用EtBr染色。
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